PKC活性檢測實驗
實驗試劑: 瓊脂糖(Promega公司，V3125) ;其他常備試劑購自sigma公司; PKC活性檢測試劑盒(Promega公司，V5330)
實驗儀器:電泳儀(北京六一廠，112-0640) ;水平電泳槽(北京六一廠，122-3146) ;電熱恒溫培養(yǎng)箱(碧云天生物，EBI025) ;電熱恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市環(huán)宇科學儀器廠，HH-8)
基本原理:分離PKC蛋白(磷酸化蛋白及非磷酸化蛋白)，利用試劑盒組分將2種蛋白分離并加以區(qū)分,利用電泳瓊脂糖凝膠技術(shù)顯示2種不同的蛋白，利用分析軟件將顯示的不同蛋白定量并加以比較，以磷酸化PKC非磷酸化PKC灰度值IOD的比值顯示PKC活性(PKC活化度)。
操作步驟:
1.用預冷的勻漿器把細胞勻漿。
2.在4°C，用14,000 xg離心裂解液5分鐘，保存上清。
3.用PKC抽提液預平衡1ml的DEAE纖維素柱，再把第2步中得到的上清過柱。用5m的PKC抽提液洗柱子，然后用5ml含有200mM NaCI的PKC抽提液洗脫含有PKC的組分。
4.用PKC稀釋液(PKC dilution buffer)將少量蛋白激酶C (Promtein Kinase C)稀釋到2 .5ug/ml.隨試劑盒所附的產(chǎn)品信息中標有這個酶的初始濃度。
5.用探頭超聲波破碎儀超聲處理PKC Activator Solution 20-30秒,或直到溶液變溫暖。
6.對每一個樣品，按照下面所列順序在0.5ml小離心管中混合PepTag@ PKC 5x Buffer,PepTag@ C1Peptide,超聲過的PKC Activator 5X Solution,和水。在樣品加入之前，小離心管--直要放在冰上。陰性對照將用于對反應進行定量時確定其摩爾吸收值(說明書第IV部分) 。
標準PKC檢測
PepTag@ PKC Reaction 5X Buffer 5ul
PepTag@ C1 Peptide (0.4ug/ul) 5ul
PKC Activator 5X Solution,超聲處理的 5ul
短肽保護液(非必須) 1ul
樣品 9ul
去離子水使終體積為 25ul
PKC陽性對照檢測
PepTag⑧PKC Reaction 5X Buffer 5ul
PepTag@ C1 Peptide (0 4ug/ul) 5ul
PKC Activator 5XSolution,超聲處理的 5ul
短肽保護液(非必須) 1ul
Protein Kinase C (2.5ug/ml溶于PKC dilution bufer) 4ul
去離子水使終體積為 25ul
PKC陰性對照檢測(不加PKC)
PepTag@ PKC Reaction 5X Buffer 5ul
PepTag@ C1 Peptide (0 4ug/ul) 5ul
PKC Activator 5XSolution,超聲處理的 5ul
短肽保護液(非必須) 1ul
去離子水使終體積為 25ul
7.在0時間點，把--支管子從冰上移到30°C水浴中孵育2分鐘。然后加入樣品或蛋白激酶C在30°C再孵育30分鐘。
8.把管子放進開水浴或95°C加熱塊10分鐘以終止反應。在凝膠電泳前把樣品--直避光存放在4°C或-20°C。
9.把樣品上樣到膠上之前，往每個樣品中加進1ul的80%甘油，以確保樣品保留在上樣孔中(說明書第II.F部分)。
10.每孔點樣10ul,在0. 8%瓊脂糖凝膠上以100V電泳15分鐘分開樣品，拍照。
檢測結(jié)果:
說明:后面2組泳道“陽性(PC)"和“陰性(NC)"為試劑盒自帶系統(tǒng)對照。
注:陽性條帶以Gel pro4版凝膠光密度分析軟件進行分析,測其IOD (integrated optical density)累積光密度參考值。按照百分比例計算PKC活性百分比
(以陽性對照I0D值為100，其余各組的PKC+ p-PKC總和為100分配IOD數(shù)值)
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