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WB常見(jiàn)問(wèn)題及對(duì)策
一、不好看的條帶
1.不好看的條帶大多是因?yàn)榈鞍酌附到?，造成條帶出現(xiàn)在奇怪的位置。建議使用已經(jīng)保存在冰上的新鮮樣品或換抗體。
2.如果蛋白質(zhì)位置比較高，重新加熱樣本可以幫助打破蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。
3.模糊的條帶經(jīng)常是因?yàn)檗D(zhuǎn)染過(guò)程中電壓過(guò)高或氣泡，應(yīng)確保凝膠在較低的電壓下運(yùn)行，以及轉(zhuǎn)染的三明治避免產(chǎn)生氣泡。另外，換新的電泳緩沖液可能也可以幫助解決問(wèn)題。
4.條帶不平滑，可能是由于阻力低導(dǎo)致穿過(guò)蛋白質(zhì)凝膠的速度過(guò)快，因此要選用質(zhì)量較好的樣品。
5.白色條帶是由于蛋白質(zhì)或抗體太多了。
二、條帶缺失
1.一抗或二抗有問(wèn)題。
2.抗體濃度太低。
3.有些抗體不能用于WB。
4.轉(zhuǎn)膜液、TBST、電泳緩沖液或ECL比較陳舊或有質(zhì)量問(wèn)題。
5.抗體中加入了疊氮化NA， 干擾ECL發(fā)光。
三、 目的蛋白信號(hào)弱
1.條帶信號(hào)弱可能是抗體或抗原濃度低造成的，可以嘗試增加曝光時(shí)間。
2.另一個(gè)原因可能是脫脂奶粉掩蓋了抗原。在這種情況下使用BSA 或減少使用的牛奶量。
四、背景過(guò)高
1.高背景通常是由于與PVDF膜結(jié)合的抗體濃度過(guò)高造成的。
2.另一個(gè)可能是緩沖液太舊?？梢栽囋嚩嘞匆粫?huì)。
3.曝光也可能導(dǎo)致背景過(guò)高。建議試試不同的曝光時(shí)間來(lái)找到最佳時(shí)間。
五、條帶上的斑點(diǎn)
1.條帶上出現(xiàn)斑點(diǎn)可能是轉(zhuǎn)膜的問(wèn)題。如果有氣泡出現(xiàn)在凝膠和膜之間，會(huì)在條帶上顯示很暗的影，因此趕氣泡是很重要的。
2.洗背景是至關(guān)重要的。
3.可能是由于二抗的聚合，在這種情況下，二抗可以離心并過(guò)濾以去除聚合體。
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