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一氧化氮 (Nitric oxide ，NO) 含量測定試劑盒說明書
微量法
注意：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義：
NO (Nitric Oxide ，NO) 廣泛分布于生物體內(nèi)神經(jīng)、循環(huán)、呼吸、消化、泌尿生殖等系統(tǒng) 中，特別是神經(jīng)組織中較豐富。它作為細胞間及細胞內(nèi)的信息物質(zhì)，發(fā)揮信號傳遞的作用，是 一種新型的生物信使分子，在機體的生理、病理過程中起著重要的作用。
測定原理：
NO在體內(nèi)或水溶液中極易氧化生成 NO2-，在酸性條件下，NO2-與重氮鹽磺酸胺生成重氮 化合物，進一步與萘基乙烯基二胺偶合，產(chǎn)物在550nm處有特征吸收峰，測定其吸光值，可以 計算NO含量。為了排除樣品色素等的影響，每個樣品需做對照管。
自備實驗用品及儀器：
天平、研缽或勻漿器、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96 孔板、蒸餾水。
試劑組成和配制：
提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存。
試劑一：液體 3mL×1 瓶，4℃避光保存。
試劑二：液體 3mL×1 瓶，4℃保存。
試劑三：液體 6mL×1 瓶，4℃避光保存。
樣品處理：
1. 組織：按照組織質(zhì)量 (g) ：提取液體積(mL)為1：5~ 10的比例 (建議稱取約0. 1g組織，加入 1mL提取液) 進行冰浴勻漿。10000g ，4℃離心 15min ，取上清，置冰上待測。
2. 細菌、真菌：按照細胞數(shù)量 (104個) ：提取液體積 (mL) 為500~ 1000：1的比例 (建議500 萬細胞加入1mL提取液) ，冰浴超聲波破碎細胞 (功率300w ，超聲3秒，間隔7秒，總時間 3min ) ；然后10000g ，4℃ ，離心 15min ，取上清置于冰上待測。
3. 體液和培養(yǎng)液等其它液態(tài)樣品：直接測定。
測定步驟和操作表：
1 、 分光光度計或酶標儀預(yù)熱30min 以上，調(diào)節(jié)波長至550nm。
2 、 操作表
對照管 | 測定管 | |
樣品 (μL) | 100 | 100 |
試劑一 (μL) | 50 | |
試劑二 (μL) | 50 | |
試劑三 (μL) | 50 | 50 |
混勻，4℃室溫靜置 15min ，于微量石英比色皿/96 孔板，對照管調(diào)零，測定 550nm 處吸光 值，記為 A 550 。 | ||
NO 含量計算：
a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下
標準曲線回歸方程為：y=0.016x-0.0103 ，R2=0. 9986
1 、組織樣品：
NO含量定義：25℃時，每克樣品或每毫克蛋白15min生成1μmoL NO2-，相當于1μmoL NO。
(1) 按樣本質(zhì)量計算
NO 含量 (μmoL/g) = (A 550 +0.0103) ÷0.016×V 反總÷ (V 樣÷V 樣總×W) ×10 -3
= 0. 125× (A 550 +0.0103) ÷W
(2) 按樣本蛋白濃度計算
NO 含量 (μmoL/mg prot) = (A 550 +0.0103) ÷0.016×V 反總÷ (V 樣×Cpr) ×10 -3 = 0. 125× (A 550 +0.0103) ÷Cpr
2 、其他樣品：
NO 含量定義：25℃時，每升樣品15min生成 1μmoL NO2- ，相當于1μmoL NO。 NO 含量 (μmoL/L) = (A 550+0.0103) ÷0.016×V 反總÷V 樣
= 125× (A 550+0.0103)
V 反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V 樣：反應(yīng)中樣品體積，0. 1mL；V 樣總：加入提取液體積， 1mL；W：樣品質(zhì)量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/mL
b. 用 96 孔板測定的計算公式如下
標準曲線回歸方程為：y= 0.008x-0.0103 ，R2=0. 9986
1 、組織樣品：
NO含量定義：25℃時，每克樣品或每毫克蛋白15min生成 1μmoL NO2-，相當于1μmoL NO。 (1) 按樣本重量計算
NO 含量 (μmoL/g) = (A 550 +0.0103) ÷0.008×V 反總÷ (V 樣÷V 樣總×W) ×10 -3
= 0.25× (A 550+0.0103) ÷W
(2) 按樣本蛋白濃度計算
NO 含量 (μmoL/mg prot) = (A 550+0.0103) ÷0.008×V 反總÷ (V 樣×Cpr) ×10 -3 = 0.25× (A 550+0.0103) ÷ Cpr
2 、細胞
NO 含量定義：25℃時，每104個細胞15min 生成 1μmoL NO2- ，相當于1μmoL NO。
NO 含量 (μmol/104cell) = (A 550+0.0103) ÷0.008×V反總÷ (V樣÷V樣總×細胞數(shù)量) ×10 -3= 0.25× (A 550+0.0103) ÷細胞數(shù)量 (萬個)
3 、 其他樣品：
NO 含量定義：25℃時，每升樣品 15min 生成 1μmoL NO2- ，相當于1μmoL NO。
NO 含量 (μmoL/L) = (A 550 +0.0103) ÷0.008× V 反總÷V 樣= 250× (A 550 +0.0103) V 反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V 樣：反應(yīng)中樣品體積，0. 1mL；V 樣總：加入提取液體積， 1mL；W：樣品質(zhì)量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/mL
注意事項：
1. 試劑盒 2-8℃保存。
2. 盡量使用新鮮樣品進行檢測，試劑三有腐蝕性，操作時請做好防護措施。
3. 若檢測出得 OD 值在標準曲線范圍外，請將樣品進行適當?shù)臐饪s或稀釋，并在計算公式 中除以濃縮倍數(shù)或者乘以稀釋倍數(shù)。
4. 最DI檢出限為 0.65μmoL/L。
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