業(yè)執(zhí)照.jpg)
用超聲波破碎儀破碎大腸桿菌注意事項(xiàng)
用大腸桿菌表達(dá)外源蛋白，在進(jìn)行超聲波破碎之前，用含有1%triton-X-100的PBS懸浮，效果較好，1%triton-X-100的作用還是很明顯的，對(duì)其他的一些細(xì)菌同樣起作用，比如鏈霉菌。
細(xì)菌沉淀直接加樣品1 buffer，再加5μl的巰基乙醇，混勻，離心，煮沸10min，直接上樣，染色脫色步驟如下:將膠放入適量的染色液微波爐里加熱1min(下次適當(dāng)補(bǔ)點(diǎn)醋酸即可),將染色液換成大量的水(自來(lái)水即可)在微波爐煮10min 就可以。在表達(dá)重組蛋白后超聲波破碎細(xì)胞，采用冰浴，400w，破2s停1s，但是不一會(huì)就產(chǎn)生大量泡沫，影響了破碎功率， pbs和tris緩沖液都是這樣，后都是破碎不*，而我的目的蛋白就在這些未破碎的細(xì)胞中。
1*會(huì)產(chǎn)生氣泡是因?yàn)槟愕奶筋^位置沒(méi)放好。超聲波破碎儀探頭一定要接近底部，約1cm（推薦是距底部0.5mm）。功率根據(jù)儀器不同會(huì)有所不同，但你可以觀(guān)察液面，有波動(dòng)但不要太劇烈就好。
2*破3s停10s，破碎20-30個(gè)循環(huán)觀(guān)察效果。
3*探頭位置擺放也要注意，聽(tīng)聲音如果不對(duì)的話(huà)就要及時(shí)調(diào)整。另外可以從菌濃度方面考慮。 在超聲波破碎時(shí)試著加大體積,振幅盡量不要超過(guò)60%.
4*嘗試超8s停8s,對(duì)有些菌體蛋白來(lái)說(shuō)，通常方法很難散熱，導(dǎo)致蛋白變性產(chǎn)生氣泡，停頓時(shí)間稍長(zhǎng)一些，這種情況多見(jiàn)于包涵體形式的蛋白。如果換用Branson超聲波破碎儀來(lái)進(jìn)行工作，由于熱耗較小，停頓周期可適當(dāng)減小。
